Is analógach de tsubstráit β-galactosidase é IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside), atá an-ionduchtaithe. Faoi ionduchtú IPTG, is féidir leis an ionduchtóir coimpléasc a fhoirmiú leis an bpróitéin coscaire, ionas go n-athraítear comhréireacht an phróitéine coscaire, ionas nach féidir é a chomhcheangal leis an ngéin sprice, agus go gcuirtear an ghéin sprice in iúl go héifeachtúil. Mar sin, conas ba chóir tiúchan IPTG a chinneadh le linn an turgnaimh? An ea is mó is ea is fearr?
Ar dtús, tuigfimid prionsabal ionduchtaithe IPTG: Tá trí ghéin struchtúracha, Z, Y, agus A, in oibreoir (eilimint) lachtós E. coli, a chódaíonn β-galactosidase, permease, agus aicéitiltransferase, faoi seach. Déanann lacZ lachtós a hidrealú ina ghlúcós agus ina galactose, nó ina allo-lachtós; ligeann lacY do lachtós sa timpeallacht dul tríd an membrane cille agus dul isteach sa chill; aistríonn lacA an grúpa aicéitile ó aicéitil-CoA go β-galactoside, rud a bhaineann le héifeacht Thocsaineach a bhaint. Ina theannta sin, tá seicheamh oibriúcháin O, seicheamh tosaigh P agus géin rialála I ann. Is próitéin athshocraithe é cód géine I ar féidir leis ceangal leis an suíomh O den seicheamh oibreora, ionas go ndéantar an t-oibreoir (meata) a chosc agus a mhúchadh. Tá suíomh ceangailteach ann freisin do shuíomh ceangailteach próitéine gníomhachtaithe géine catabólaigh - CAP suas srutha ón seicheamh tosaigh P. Is ionann an seicheamh P, an seicheamh O agus an suíomh ceangailteach CAP le chéile agus réigiún rialála an oibreoir lac. Rialaítear géinte códaithe na dtrí einsím ag an réigiún rialála céanna chun léiriú comhordaithe táirgí géine a bhaint amach.
In éagmais lachtós, bíonn an t-oibreoir lac (meta) i riocht coiscthe. Ag an am seo, ceanglaíonn an t-athbhrúiteoir lac a chuireann an seicheamh I in iúl faoi rialú an tseicheamh tionscnóra PI leis an seicheamh O, rud a chuireann cosc ar pholaiméaráis RNA ceangal leis an seicheamh P agus a chuireann bac ar thionscnamh trascríobh; nuair a bhíonn lachtós i láthair, is féidir an t-oibreoir lac (meta) a spreagadh. Sa chóras oibreora (meta) seo, ní lachtós féin an fíor-ionduchtóir. Téann lachtós isteach sa chill agus déanann β-galactosidase é a chatalú le go ndéanfar é a thiontú ina allolactose. Ceanglaíonn an dara ceann, mar mhóilín ionduchtóra, leis an bpróitéin athbhrúiteora agus athraíonn sé comhréireacht an phróitéine, rud a fhágann go ndéantar an phróitéin athbhrúiteora a dhícheangal ón seicheamh O agus go ndéantar trascríobh. Tá an éifeacht chéanna ag isopropylthiogalactoside (IPTG) le allolactose. Is ionduchtóir an-chumhachtach é, nach ndéanann baictéir a mheitibiliú agus atá an-chobhsaí, mar sin úsáidtear go forleathan é i saotharlanna.
Conas an tiúchan is fearr de IPTG a chinneadh? Tóg E. coli mar shampla.
Rinneadh an strain E. coli BL21, a ndearnadh innealtóireacht ghéiniteach air, ina raibh an pGEX athchuingreach dearfach (CGRP/msCT) a ionaclú i meán leachtach LB ina raibh 50μg·mL-1 Amp, agus rinneadh é a shaothrú thar oíche ag 37°C. Rinneadh an cultúr thuas a ionaclú i 10 mbuidéal de mheán leachtach úr LB 50mL ina raibh 50μg·mL-1 Amp ag cóimheas 1:100 le haghaidh cultúr leathnaithe, agus nuair a bhí an luach OD600 0.6~0.8, cuireadh IPTG leis an tiúchan deiridh. Is é 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1. Tar éis ionduchtaithe ag an teocht chéanna agus ag an am céanna, tógadh 1 mL den tuaslagán baictéarach uaidh, agus bailíodh na cealla baictéaracha trí lártheifneoiriú agus rinneadh SDS-PAGE orthu chun tionchar tiúchan IPTG éagsúla ar léiriú próitéine a anailísiú, agus ansin an tiúchan IPTG leis an léiriú próitéine is mó a roghnú.
Tar éis turgnaimh, gheofar amach nach bhfuil tiúchan IPTG chomh mór agus is féidir. Tá sé seo amhlaidh toisc go bhfuil tocsaineacht áirithe ag IPTG do bhaictéir. Má sháraítear an tiúchan, marófar an chill freisin; agus go ginearálta, tá súil againn go mbeidh an próitéin intuaslagtha sa chill níos fearr, ach i go leor cásanna nuair a bhíonn tiúchan IPTG ró-ard, cruthófar méid mór próitéine intuaslagtha. Sa chorp, ach laghdaítear méid na próitéine intuaslagtha. Dá bhrí sin, is minic nach é an tiúchan IPTG is oiriúnaí, dá mhéad is amhlaidh is fearr, ach dá ísle an tiúchan.
Is é cuspóir ionduchtú agus saothrú cineálacha innealtóireachta géiniteacha ná toradh an phróitéine sprice a mhéadú agus costais a laghdú. Ní hamháin go mbíonn tionchar ag fachtóirí an tsraithe féin agus an plaismíd léirithe ar léiriú an ghéin sprice, ach bíonn tionchar ag coinníollacha seachtracha eile freisin, amhail tiúchan an ionduchtóra, an teocht ionduchtaithe agus an t-am ionduchtaithe. Dá bhrí sin, go ginearálta, sula ndéantar próitéin anaithnid a léiriú agus a íonú, is fearr an t-am ionduchtaithe, an teocht agus tiúchan IPTG a scrúdú chun na coinníollacha cuí a roghnú agus na torthaí turgnamhacha is fearr a fháil.
Am an phoist: 31 Nollaig 2021